（1福建省农业科学院畜牧兽医研究所2 广州市华南农大生物药品有限公司）
基金项目：现代农业产业技术体系建设专项资金（CARS-43），福建省农业五新工程项目（闽发改投资（2012）931号）
摘要：目的：观察十二烷基硫酸钠（SDS）肌注对家禽的副作用；建立检测禽霍乱荚膜粗提物中的SDS残留量的方法。方法：肌肉注射0.01％SDS溶液、0.05％的SDS溶液，观察家禽的全身及局部反应。不同浓度SDS溶液与吖啶橙混合，作用后甲苯抽提，测定499nm的光吸收值，建立回归方程。根据待检品的光吸收值求出其SDS浓度。结果：肌注后1天内，所有家禽在注射部位均有轻微的压痛表现，1天后缓解，继续观察至14天，未见家禽表现全身和局部反应。 当SDS的浓度在0.001％~0.005％时，与OD499呈线性相关，相关系数为0.9969。结论：0.01％和0.05％的SDS溶液肌注，对家禽没有副作用。吖啶橙-分光光度法可以用来检测禽霍乱荚膜粗提物中的SDS残留。
关键词：多杀性巴氏杆菌 荚膜 吖啶橙 SDS
禽霍乱，又名禽巴氏杆菌病、禽出血性败血症，是侵害家禽和野禽的一种慢性或急性接触性传染病。该病急性发作时表现败血症，发病率和死亡率都很高，慢性型则病情缓和，通常只引起肉髯或关节等局部的感染。许多抗菌药物能迅速控制本病，但停药后易复发，造成的损失极大。林世棠等以特殊工艺提取其荚膜，制成禽霍乱荚膜亚单位疫苗，近期免疫保护率为80％以上[2-7]。在禽多杀性巴氏杆菌荚膜的提取过程中，需加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），虽然在后续的工艺中含有去除SDS的步骤，但其残留是不可避免的。过量的SDS会对机体产生副作用，人用生物制品中该残留量应控制在0.05％左右的安全范围内[8、9]。SDS残留对家禽的影响尚未见报道，本试验观察0.01％和0.05％的SDS溶液肌注后，SPF鸡、麻鸭和长乐灰鹅的全身及局部反应，为禽用生物制品中SDS的残留范围规定提供依据，同时还建立了检测荚膜提取物中SDS残留的方法，现报道如下。
1 材料与方法
1.1仪器
UV1600型紫外可见分光光度计，北京瑞利分析仪器公司。
1.2 试剂及溶液的配制
吖啶橙，Biosesharp公司产品；SDS，Sigma公司产品；NaHSO4·H2O，甲苯，均为分析纯。
称取6.9000g的NaHSO4·H2O加入双蒸水溶解，定容至100mL，为0.5M NaHSO4溶液。
称取0.4000g的吖啶橙，加入0.5M NaHSO4溶液溶解，定容至100mL，为0.4％吖啶橙溶液。
称取0.1000g的SDS，加入双蒸水溶解，定容至100mL，为0.1％的SDS溶液。取少量稀释成0.01％和0.05％的浓度，用于动物试验；取少量稀释成0.001％、0.002％、0.003％、0.004％和0.005％，作为检测的标准品。
待检品为禽多杀性巴氏杆菌荚膜粗提物，批号为20131211、20131215、20131220和20131228，由本实验室制备。
1.3 不同浓度SDS溶液对禽类的影响
选择30日龄的SPF鸡、麻鸭和长乐灰鹅，详细分组见表1，0.01％的SDS溶液（滤膜除菌）、0.05％的SDS溶液（滤膜除菌）、灭菌生理盐水，分别肌注10羽实验动物，每羽于左、右腿部肌肉各注射1mL。同条件隔离饲养14天，提供充足的饲料和饮水。期间每日观察实验动物的临床状况，包括精神状态、行为活动、眼睛和鼻孔分泌物、采食和排便情况等；局部不良反应包括红肿、硬结、瘙痒和压痛等。分别于肌注后1天、3天和5天各扑杀2羽，观察注射部位的肉眼变化。
1.4 SDS浓度与光吸收值的对应关系
取100µL标准品于带塞试管中，加入100µ L0.4％吖啶橙溶液混匀。加入3mL甲苯后塞紧试管，剧烈振荡3min，3000g离心5min，吸上清测定499nm处的光吸收值，用双蒸水作参比。每个标准品进行3个重复，取平均值。以SDS浓度为横坐标，以光吸收值为纵坐标，绘制曲线，求相关系数，建立回归方程。
1.5 待检晶SDS残留量的测定
方法同1.4，每个待检品进行3个重复，取平均值。将光吸收值代人回归方程，计算待检品的SDS浓度。
2 结果
2.1 SDS溶液对禽类的影响
0.01％的SDS溶液、0.05％的SDS溶液和生理盐水注射后，各组动物的临床表现相似，精神状态良好，行为活动正常，眼睛和鼻孔无异常分泌物，采食和排便正常。肌注后1天内，所有动物在注射部位均无出现红肿、硬结，但有轻微的局部压痛表现。肌注后1天，局部压痛消失，观察到肌注后14天，注射部位仍无硬结。肌注后1天扑杀，各试验组表现相同，仅在注射部位见小出血点。肌注后3天扑杀，各试验组表现相同，在注射部位肉眼见不到异常变化。肌注后5天扑杀，各试验组均没有肉眼可见病变。
2.2 SDS浓度与光吸收值的回归曲线
各标准品的平均光吸收值见表2，以SDS浓度为横坐标，以光吸收值为纵坐标，绘制的标准曲线见图1，当SDS的浓度在0.001％~0.005％时，相关系数为0.9969，回归方程为y=50.4x-0.002。
2.3 待检品SDS残留量的计算
各待检品的平均光吸收值见表2，全部在0.043~0.247，直接将光吸收值代人回归方程，计算出的SDS残留量见表2，4批荚膜粗提物的SDS残留量全部低于0.005％，远低于目前0.05％的残留标准。
3 讨论
目前人用生物制品SDS的残留量公认的安全指标为0.05％，但兽用生物制品SDS的残留量安全指标没有明文规定。本试验以30日龄的SPF鸡、麻鸭和长乐灰鹅为实验动物，肌肉注射2 mL的0.01％SDS溶液、0.05％的SDS溶液，除第一天有局部压痛外，未见全身反应及其他的局部反应，说明家禽肌肉注射0.05％的SDS溶液是安全的。
吖啶橙-分光光度法的原理是用吖啶橙溶液与SDS结合，产生SDS-吖啶橙复合物，再用甲苯从水溶液中抽提出来进行比色测定[10]。许国杰等（2002）和吴庆洲等（2010）也将该方法用于重组人白细胞介素和双质粒疫苗中SDS的检测，证实是可行的。本试验参考他们的方法，当SDS的浓度在0.001％~0.005％时，相关系数为0.9969，此时，OD吸收值与SDS的浓度相关性非常强。测定了4批禽多杀性巴氏杆菌荚膜粗提物的SDS残留，均在0.005％以下，对家禽是安全的。
参考文献
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